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克隆感受態(tài)細胞在操作時有哪些注意事項

更新時間:2024-03-20      點擊次數:905
Mach1-T1菌株由野生型non-K-12 E. Coli W菌株改造而來,是目前生長速度較快的感受態(tài)細胞之一,在平板上9h可見克隆,缺失核酸內切酶 (endA),提高了質粒DNA的產量和質量;重組酶缺陷型 (recA1398)減少插入片段的同源重組概率,保證了插入DNA的穩(wěn)定性;lacZ M15的存在使Mach1-T1可用于藍、白斑篩選;tonA突變賦予Mach1-T1菌株對噬菌體T1和T5的抗性。Mach1-T1感受態(tài)細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率>5x108 cfu/μg DNA。
注意事項:
1、感受態(tài)細胞建議在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內加入目標DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存放會降低轉化效率。
2、混入目的DNA時應輕柔操作。
3、轉化高濃度的質?;蚋咝实倪B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。
操作說明:
1.Mach1-T1感受態(tài)細胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,待菌塊融化,加入目的 DNA(質?;蜻B接產物)并用手打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打),冰中靜置 25分鐘。
2.42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘,晃動會降低轉化效率。
3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌2YT或LB培養(yǎng)基,混勻后37℃,200rpm復蘇60分鐘。
4.5000rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。
5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。如果進行藍白斑篩選操作,將平板放37℃至少至少13h。

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