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發(fā)根(電擊)感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作說明

更新時(shí)間:2024-04-11      點(diǎn)擊次數(shù):894
發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌,它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個(gè)別裸子植物。
操作說明:
一:0.1cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
二:取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,最好用試劑盒抽提,雙蒸水溶解;轉(zhuǎn)化效率較高,第一次使用前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量),用手bo打管底混勻,立即插入冰中,用200μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中,蓋上杯蓋,空管保留待用。
三:啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25μF,PC=200ohm,V=2400V(此參數(shù)為Biorad推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯從冰中拿出,吸水紙吸干外表面水份,快速放入電轉(zhuǎn)槽中,啟動(dòng)電擊,電擊完成快速插入冰中,加入1ml無抗生素的TY,并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。
四:6000rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的TY平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。
 
 
 

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