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酵母感受態(tài)細(xì)胞的操作說明及注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2024-11-12      點(diǎn)擊次數(shù):1009
質(zhì)粒pYES2的篩選標(biāo)志為URA,可用SD-URA板板進(jìn)行篩選。BY4742感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pYES2質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA。
操作說明:
1、取一支無(wú)菌的1.5mlEP管,依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒1-3µg,Carrier DNA 10µl(95-100 度5min 快速冰浴,重復(fù)一次),100µl冰上融化的AH109感受態(tài)細(xì)胞,PEG/LiAc500µl,輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次; 
2、30℃水浴30min,每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次;
3、每支加入20µl的二甲基亞砜;(用于提高轉(zhuǎn)化效率,可不做)
4、42℃水浴15min,每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次;
5、12000rpm瞬時(shí)離心棄上清,每支加入1ml的YPDPlus于30℃復(fù)蘇1h;(用于提高轉(zhuǎn)化效率,可不做)
6、12000rpm瞬時(shí)離心棄上清,用100µl0.9%NaCl重懸,涂板,30℃培養(yǎng)48-96h。
注意事項(xiàng):
1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。
2、若使用pYES2質(zhì)粒表達(dá)蛋白,需在培養(yǎng)基中加入2%的半乳糖(篩選培養(yǎng)基中不用加半乳糖;當(dāng)需要目的蛋白表達(dá)時(shí),需加入半乳糖代替葡萄糖作為碳源),以誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。
3、轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)??上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
4、同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。
5、酵母為真核生物,不易長(zhǎng)期保存,隨感受態(tài)在-80℃保存時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化效率會(huì)不斷下降,建議保存時(shí)間不超過90天。
6、BY4742酵母菌株對(duì)高溫敏感,適生長(zhǎng)溫度為27-30℃;高于31℃,生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
7、酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長(zhǎng)越慢,以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48h培養(yǎng)可見直徑1mm克?。煌縎D單缺平板29℃,48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。
 

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