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克隆 (電擊) 感受態(tài)細(xì)胞的常規(guī)操作方法

更新時(shí)間:2024-12-09      點(diǎn)擊次數(shù):706
TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化,不能用于熱激轉(zhuǎn)化。TOP-10來(lái)源于MC1061菌株,是目前實(shí)驗(yàn)室常用的感受態(tài)細(xì)胞之一,基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型,而 TOP-10為galU型)。 
操作說(shuō)明:
一、0.1cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。 
二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5分鐘,待其融化,加入目的DNA (質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物)并用手bo打EP管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。
A.測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1μl 10pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒pUC19;  
B.對(duì)于連接產(chǎn)物,請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液(10mM TrisHCl,pH7.5;1mM EDTA)重懸,DNA濃度不超過100ng/μl,體積不超過5μl/50μl 感受態(tài)。 
三、用200μl槍頭將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。 
四、啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25μF,PC=200Ω,V=1.8kV(此為BioRad電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。  
五、2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700μl不含抗生素的無(wú)菌S.O.C.培養(yǎng)基(室溫),用1ml槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50ml離心管(BD Falcon50ml錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加S.O.C.培養(yǎng)基至5ml。37℃,225rpm 復(fù)蘇60分鐘。
六、5000rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè))。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時(shí)。

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