NMY51 Chemically Competent Cell  酵母感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

MATahis3200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4-HIS3ura3::(lexAop)8-lacZade2::(lexAop) 8-ADE2 GAL4

簡(jiǎn)要說明：

DUAL membrane系統(tǒng)是專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測(cè)技術(shù)，它利用分離的泛素系統(tǒng) 直接檢測(cè)天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用NMY51酵母菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)；此菌株Transformationmarker為：trp1，leu2-3，報(bào)告基因?yàn)椋篐IS3，ADE2和 lacZ，第一步通過營(yíng)養(yǎng)缺陷型報(bào)告基因 (HIS3，ADE2)進(jìn)行選擇性生長(zhǎng)篩選，進(jìn)一步通過 LacZ報(bào)告基因進(jìn)行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個(gè)獨(dú)立的報(bào)告基因，受不同啟動(dòng)子的調(diào)控，降低假陽(yáng)性幾率。此系統(tǒng)可使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-C，pBT3-SUC，pBT3-STE，篩選標(biāo)志均為L(zhǎng)EU；四種Prey質(zhì)粒：pPR3-C，pPR3-N，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標(biāo)志均為TRP。NMY51感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA。

操作說明：

1. 取pBait-AbAi質(zhì)粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收；

2. 取一支無(wú)菌的1.5ml EP管，依次加入預(yù)冷的預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復(fù)一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

5. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

6. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復(fù)蘇1h（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

7. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，用100µl 0.9% NaCl重懸，涂板，30℃培養(yǎng)48-96h。

注意事項(xiàng)：

1.PEG在低溫下易析出，請(qǐng)?jiān)诔叵聎an全溶解后使用。

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3.同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4.Y1HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5.菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克?。煌縎D單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。